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 Methoden - TEM - Präparationsmethoden - Biologische Objekte - Gefrierätzung

 

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EM-Labor


 

Gefrierbruch-/Gefrierätztechniken:

Die Gefrierbruch-/Gefrierätztechnik wird zur Herstellung eines kontrastreichen Metallabdrucks (Replika) von Oberflächen gefrorener Suspensionen von Makromolekülen oder Zellen eingesetzt. Das Prinzip der Gefrierätzung ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. 

Abb. 1. Präparationsschritte der Gefrierätzung. 

Das gefrorene Objekt (1) wird auf einen auf -100°C gekühlten Objekttisch in der Gefrierätzanlage übertragen und anschließend im Hochvakuum (< 10-5 mbar) und bei -100°C mittels einer auf Stickstofftemperatur gekühlten Mikrotomeinrichtung gebrochen (2). Damit werden einige im Eis eingebettete Strukturen freigelegt. Die Freilegung der noch in der Eismatrix eingebetteten Strukturen erfolgt durch Ätzung (3), d.h. durch Sublimation einer Eisschicht von etwa 500 nm Dicke im Vakuum. Dabei wirkt das über dem Präparat gehaltene, auf flüssig Stickstofftemperatur gekühlte Mikrotom als Kühlfalle. 
Nach Beendigung der Ätzung wird das „Bruch- und Sublimationsrelief“ üblicherweise durch eine Schwermetallschrägbeschattung (Einfallswinkel 10°-45°) mit etwa 1,5 nm Pt/C oder Ta/W abgebildet (Oberflächentopographie) (4). Als Alternative und zur Abbildung der Oberflächentopochemie wird nach dem Abkühlen des Objektes auf -110°C ein dünner Metallfilm (ca. eine Monolage dick) aus Au, Ag oder Pt unter senkrechtem Einfall aufgedampft (Dekoration mit Schwermetallen). Der Metallabdruck wird durch zusätzliches Aufdampfen einer 5-6 nm dicken Kohleschicht (senkrecht zur Probenoberfläche) stabilisert. 
Nach der Replikation wird der Abdruck auf Wasser abflotiert, gereinigt (5), auf ein Objektträgernetzchen aus Kupfer aufgebracht und im TEM betrachtet. 

Gefrierätzung/Kontrasterhöhung durch Schwermetallbeschattung im Hochvakuum bietet für die Untersuchung von biologischen Oberflächen einige Vorteile: 

  • Die Replikas zeigen ausgezeichneten Kontrast und eine hohe mechanische Stabilität. 
    Die hohe Beständigkeit im Elektronenstrahl erlaubt eine Beobachtung bei Elektronendosen, welche bei direkt durchstrahlen biologischen Objekten dramatische Schäden hervorrufen. 

  • Replikationstechniken sind anwendbar auf Objekte, die wegen ihrer Dicke im TEM nicht direkt untersucht werden können. 

  • Die Schrägbeschattungsreplikas enthalten 3-dimensionale Information über das Objektrelief. Durch Reliefrekonstruktionstechniken ist es möglich, quantitative Information über die 3-dimensionale Oberflächentopographie schräg beschatteter Objekte zu gewinnen. 

Gefrierätzung ist heute eine Standardtechnik in der zellbiologischen TEM. Sie trug wesentlich zum Verständnis biologischer Membranstrukturen bei; mit ihrer Anwendung wurden auch neue Wege für die Untersuchung von hydratisierten biologischen Makromolekülen und Molekülaggregaten erschlossen. Einige Beispiele gefriergeätzter biologischer Objekte sind in folgenden Abbildungen gezeigt. 

Links: Lichtmikroskopische Aufnahme von Kristallen eines oligomeren, globulären Proteinkomplexes mit ca. 150 Å Durchmesser. Rechts: TEM-Aufnahme gefriergeätzter, Pt/C-schrägbeschatteter Kristalle des Proteinkomplexes. Auf Kristalloberflächen sind die einzelnen Moleküle sowie deren Anordnung im Gitter zu sehen. 

 

Gefriergeätzte und Pt/C-schrägbeschattete Liposomen aus E. coli Lipiden mit membranintegrierten Kanalproteinen. 

 

Euglena, gefriergeätzt und Pt/C-schrägbeschattet.